虹彩病毒DIV1，研究有新突破！这种新型虾类病毒，不受水温的影响

南美白对虾是一种重要的、全球养殖最多的水产养殖物种。随着虾产量的增长，由原生动物、真菌、细菌和病毒引起的各种疾病的暴发也显著增加，其中，病毒感染是所有虾类疾病中最严重的一种。白斑病和陶拉综合征是影响虾的广泛的病毒疾病。

近年来，病毒性疾病给水产养殖造成巨大的经济损失，严重影响水产养殖的发展。因此，了解虾病毒感染是未来水产养殖必备的技能。

一、虹彩病毒病

虹彩病毒科宿主范围广泛，可感染脊椎动物和无脊椎动物，比如可以感染昆虫、两栖动物和鱼类，它们在水生物种中广泛分布，可能导致大规模损失。2017年，中国水产科学研究院黄海水产研究所从采集的样本中分离出一种新型病毒。组织病理学显示造血组织和鳃、肝胰腺、腹足和肌肉的血细胞中有病毒包涵体，对其主要衣壳蛋白(MCP)氨基酸序列和ATPase进行多基因分析，结果表明该病毒属于虹彩病毒科，但不属于任何已知的类别。因此，该病毒被临时命名为DIV1。

研究人员发现，被DIV1感染的南美白对虾的死亡率很高，在15天内的死亡率为100%，并且生病的虾由于游泳能力差而沉入水底。研究人员已经对DIV1的全基因组进行了测序，并建立了实时PCR检测方法来检测和量化DIV1。该方法具有灵敏度高、特异性强的优点，是一种简便、准确定量DIV1的方法。

虾是变温动物，这意味着它们没有控制体温的系统。因此，环境温度决定了他们的体温，许多关键的酶活性也受到体温的影响。热休克蛋白(HSPs)在环境温度变化时被诱导，这一过程被称为热休克应激反应。虽然温度会上调热休克反应，但它们对所有细胞和应激源都是通用的，包括：毒素、蛋白质降解、缺氧和微生物感染。温度波动也会影响虾的生理活动，如：生长、抗病和代谢率。此外，研究表明，温度影响各种虾病毒的复制速度。

研究学家们，对水温给虾类带来的影响进行了很多研究，包括：水温对虾类发育和进食的影响，以及虾类免疫反应的变化。水温的波动会降低虾的抵抗力，使它们更容易生病。根据Wyban等人的研究，对虾的理想水温为23°C-30°C。当水温降低到15°C-22°C，或者提高到30°C-33°C时，对虾会压力大增。研究人员还研究了温度对虾中流行病毒的影响。其中，温度可以降低了感染白斑综合征病毒(WSSV) 和陶拉综合征病毒对虾的致死率。它抑制了WSSV和传染性皮下和造血坏死病毒(IHHNV)的增殖。当水温保持在21°C-30°C时，病毒繁殖迅速，但在其他温度下则受到一定程度的抑制。

目前，还没有关于温度对DIV1感染的南美白对虾影响的研究。因此，本研究的目的是确定，高水温是否影响DIV1。本研究评估了南美白对虾在不同组织中的病毒增殖和存活率。以往的研究表明，提高养殖水体温度会抑制WSSV、TSV和IHHNV的生长和生存率。因此，本研究重点研究了高水温对DIV1的影响。

二、研究设计

1、研究采用的南美对虾(平均体长6.70±0.67cm，平均体重3.58±1.0g)，并且随机取样，通过PCR检测，以确保他们没有感染IHHNV、WSSV和DIV1。

2、DIV1提取自自然感染的南美白对虾。简单地说，将自然感染的南美白对虾组织提取之后，分离出DIV1，然后肌注健康南美白对虾当中，使之感染DIV1。

3、将这些感染了DIV1的南美白对虾和未感染DIV1的南美白对虾，分别放置在两种水温当中（26±1℃、32±1°C），测试未感染DIV1和感染DIV1虾，在不同水温当中的生存率和生长性能，试验时间为96小时。

三、研究结果

根据质粒拷贝数与Ct值的关系，我们得到如下的标准曲线:Ct = -3.3358X 44.362 (X为Log10浓度(DNA拷贝数))。相关指数(r2)为0.9996(图1、2)

图1：实时荧光定量PCR。

图2：定量PCR标准曲线。

1、温度对虾存活率的影响

在相同水温下，试验组(感染组)与对照组(未感染组)差异极大，96小时实验组的存活率显著低于对照组。26±1℃感染组的存活率为4.44%，26±1℃对照组的存活率为78.89%。32±1°C感染组成活率为2.22%，32±1°C对照组成活率为86.67%。26±1℃和32±1℃感染组的存活率均小于5%。32±1℃感染组的死亡高峰时间为12小时，比26±1℃感染组(18小时)早6小时。

另外。低温(26±1℃)感染组的存活率稳定在48小时之后，32±1℃感染组的存活率稳定在30小时之后(图3)。

图3：温度对DIV1感染的南美南美白对虾存活率的影响。

2、温度对DIV1拷贝的影响

通过qPCR分析表明，感染虾的其他组织中DIV1拷贝数不断积累。在26±1°C时，每个感染组织的DIV1拷贝数在6小时和24小时当中差异显著。DIV1在肠道中复制速度最快，检测到的数量也最多。从6小时的2.9×10 7个拷贝/g到24小时的2.9×10 11个拷贝/g(图4)。相应的，在32±1℃时取样的每个组织在6小时和24小时也有显著差异。在这些组织中，肌肉显示出最高的病毒载量(图5)。

图4：26±1°C的条件下，不同时间点的鳃、肝胰腺、腹肢、肠道和肌肉的DIV1拷贝数。

图5：32±1°C的条件下，不同时间点的鳃、肝胰腺、腹肢、肠道和肌肉的DIV1拷贝数。

DIV1在两种不同水温下的复制速率不同。除肠道外，在32±1°C时，6小时的取样组织DIV1拷贝数高于26±1°C，鳃、腹肢、肌肉DIV1拷贝数差异极显著。在12小时中，肠道和肌肉中的拷贝数在32±1℃的条件下，显著高于26±1℃时。然而，在24小时后，26±1°C条件下，DIV1拷贝在鳃、肝胰腺、腹肢、肠道的数量远高于32±1°C ，,而肌肉的DIV1拷贝数，32±1°C远高于26±1°C。

四、讨论

1、在本研究中，我们研究了温度对一种新的虹彩病毒DIV1感染的影响。结果表明，DIV1对南美白对虾的危害极大，在高水温和正常水温下，感染div1虾的存活率下降到5%。这一结果与之前报道的DIV1为高致病性病毒的研究并不矛盾，DIV1的高致病性可能与免疫应答有关。

2、宿主的免疫反应包括先天免疫和适应性免疫。然而，适应性免疫只存在于脊椎动物中。因此，甲壳类动物（如虾）没有免疫球蛋白，其免疫保护主要由血细胞提供。血细胞通过血液循环分布在全身，并发挥各种免疫防御功能，如：吞噬作用、结节、囊肿的形成。之前对人工感染div1的虾的研究表明，血淋巴中的病毒载量最高，免疫细胞的损伤导致虾的免疫抵抗能力下降，从而导致虾的大规模死亡。在32±1°C条件下，病虾的死亡高峰比在26±1°C条件下早6小时，这可能与在高温条件下对病虾的敏感性增加，使他们更容易感染DIV1。

另外，qPCR表明DIV1感染的早期阶段，32±1°C组病毒复制数量高于26±1°C组。

3、这项研究不同于之前对其他三种主要虾病毒病原体(WSSV、IHHNV和TSV)的研究。在这项研究中，DIV1在标准水温和高水温下都得到连续复制，只是6小时所被测组织的DIV1拷贝数与24小时的拷贝数不同，但是26±1°C和32±1°C的DIV1感染都导致高达95%的高死亡率。相反，研究表明，温度可抑制WSSV、IHHNV和TSV的复制率，并降低相关死亡率。对这种抑制的一种解释是，高温条件促进了病毒感染虾，并导致细胞的凋亡。因此，DIV1在虾体内的复制机制可能与其他流行病毒不同。

从这项研究的结果中可以得出的结论是，DIV1可以对鳃和血细胞造成严重损伤，降低南美白对虾的呼吸和免疫抗性，这种损伤不能通过提高水温来减轻。但DIV1的复制，及发病机制尚未见报道。因此，为DIV1感染找到合适的解决方案还需要进一步研究。

五、结论

本研究表明，将南美白对虾转移到较高的水温当中，对DIV1感染并无益处。在26±1°C条件下，感染DIV1的南美白对虾的存活率在48小时内下降到4.44%，在30小时内下降到2.22%。在32±1°C时，几乎所有组织都达到了感染初期病毒载量的阈值。而在26±1°C时，从6小时到24小时这个阶段，病毒复制的数量也得到大大的增强。

综上所述，DIV1感染的潜在机制，不同于WSSV, TSV和IHHNV。